Пцр машина своими руками
Секвенирование ДНК в домашних условиях: как на коленке собрать прибор за 10 миллионов
Всем привет, меня зовут Александр Соколов, и я хочу рассказать, как сделал дома секвенатор – прибор для расшифровки ДНК. Рыночная цена такого прибора составляет около 10 миллионов рублей.
Краткий экскурс в генетику. Если вдруг вы помните, в 2003 г. было сделано сенсационное заявление: ученые, наконец, расшифровали геном человека. Геном построен из ДНК, а ДНК – это исходный код организма. ДНК представляет собой двойную цепочку, состоящую из 4-х видов нуклеотидов, которые повторяются в геноме человека порядка 3 млрд. раз. Так же, как в битах зашифрована вся информация на вашем компьютере, в нуклеотидах зашифрована инструкция о сборке всех белков человеческого тела. То есть зная, в какой последовательности расположены нуклеотиды в ДНК, мы теоретически можем собрать все необходимые белки и получить модель человека. Так вот в стандартном понимании ученые не расшифровали ДНК, а просто перевели химическую последовательность в набор нулей и единиц на компьютере. Что делать с этим дальше – отдельный разговор. Например, на данный момент нам ясна функция лишь 5% всего массива генома (это кодирование белков). Чем занимаются остальные 95%, можно только предполагать.
В 2003 году стоимость секвенирования ДНК человека составляла около 100 млн долларов. С течением времени эта цифра уменьшалась и сейчас она приближается к тысяче долларов. Вы платите, вашу ДНК секвенируют и отдают вам жесткий диск с 3 ГБ информации – вашим геномом в цифровом виде.
Что ж, десяти миллионов у меня не было, а PGM захотелось. Пришлось сделать самому. Сначала вкратце о том, как происходит полупроводниковое секвенирование. Вся цепочка ДНК делится на фрагменты длиной по 300-400 нуклеотидов, называемые ридами. Затем риды прикрепляются к маленьким сферам и многократно копируются – в итоге на каждой сфере «висит» целый пучок одинаковых фрагментов ДНК. Копирование нужно для усиления сигнала от каждого конкретного рида. Набор разных сфер называется библиотекой ДНК.
Сердцем PGM является одноразовый чип – матрица, похожая на матрицу в фотокамере, только вместо пикселей, реагирующих на свет, здесь pH-транзисторы, реагирующие на изменение кислотно-щелочного баланса. Полученная библиотека ДНК загружается на чип, содержащий 10 млн лунок, на дне каждой из них находится pH-транзистор. В лунку умещается только одна сфера и, следовательно, риды только одного типа (с одной определенной последовательностью нуклеотидов). Далее на чип подаются реагенты таким образом, чтобы ДНК начала себя копировать. А копируется она линейно, то есть нуклеотиды прикрепляются к вновь создаваемой цепочке в том порядке, в котором они стоят в материнской цепочке. Поэтому на чип подается один тип нуклеотидов – и тут же фиксируется изменение pH в некоторых лунках (это значит, что в них произошло присоединение данного нуклеотида). Далее подается другой тип нуклеотидов и фиксируется изменение pH в лунках и т. д. Таким образом, подавая на чип все 4 типа нуклеотидов много раз, мы можем получить информацию о последовательности нуклеотидов в каждом риде. Затем математическими способами прочитанные короткие отрезки собираются на компьютере в единую цепочку. Чтобы собрать ее более-менее уверенно, каждый рид нужно прочесть примерно по 100 раз.
Рис.1. Полупроводниковое секвенирование
Теперь разберемся, из чего состоит сам прибор. Имеется, как мы уже знаем, чип, а также система подачи реагентов и материнская плата. Все секвенирование ведется именно на чипе – остальной аппарат только передает на него определенные сигналы, подает реагенты, считывает с него аналоговые сигналы, оцифровывает их и гонит полученный поток информации на компьютер, где данные накапливаются и обрабатываются.
Рис. 2. Устройство секвенатора
Чип позиционируется как одноразовый и после использования выкидывается. Соответственно, там, где работает PGM, такие чипы можно достать бесплатно в любом количестве. Зачем их доставать, спросите вы? Дело в том, что чип мне уже удалось использовать многократно. По сути он вечен: достаточно хорошо промывать его – и можно применять вновь и вновь. По точности работы он ничем не будет отличаться от нового. Сама моя идея заключалась в том, чтобы сделать прибор под этот условно бесплатный чип.
Рис. 3. Прозвонка чипа
А затем внезапно на Habrahabr мне попалась статья известного блоггера BarsMonster о том, как он делает реверс-инжиниринг чипов! Воодушевился, написал ему, написал другим энтузиастам, отправил запрос в Киев, где занимались фотографированием чипов. Из Киева ответили, что полировать по слоям они не умеют, могут только отснять верхний слой, а так как мой чип – многослойный, будет не понятно, куда идут дорожки от контактов. Потом познакомился с одним американцем, который тоже занимается реверс-инжинирингом чипов, послал ему свои микросхемы, но и тут дальше фотографирования верхнего слоя дело не пошло. Затем наткнулся в интернете на статью про тех, кто смог отреверсить чип Sony PlayStation и пр. («Слава героям!» и вот это все, если кто в курсе). Решил написать им с вопросами, нашел их ники – и тут же понял, что один из них мне знаком. Недавно товарищ свел меня со своим другом, который «тоже занимается генетикой на любительском уровне», мы пообщались с этим другом в Skype и на этом диалог закончили. И вот я понимаю, что мой новый приятель – мегакрутой мастер реверс-инжиниринга чипов. Тут же написал ему. Однако выяснилось, что, хоть помочь он и готов, у него нет микроскопа. Снова тупик.
А через несколько месяцев нужный микроскоп нашелся в соседней лаборатории! Правда, встроенная в него камера была ужасной, я фотографировал на мобильный телефон через окуляр и получал снимки вот такого качества:
Рис. 4. Чип под микроскопом
Затем на последний Новый год отличный микроскоп за 130 тыс. появился у меня на работе (я – специалист по квантовой криптографии). Мечты сбываются. Наконец, я смог нормально сфотографировать чип сверху.
Рис. 5. Мой рабочий микроскоп
А потом… Потом мне все-таки пришлось самому освоить технику его полировки. Трудность полировки заключается в том, чтобы снимать слои металла толщиной порядка 1 микрона – при этом ширина чипа составляет 1 сантиметр. Для сравнения скажу, что это примерно то же, что допустить на 1 км погрешность не более 10 см. Я очень старался. Результаты моих трудов представлены на следующем фото:
Рис. 6. Реверс-инжиниринг под оптическим микроскопом
Довольно хорошо видны нижний кремниевый слой, верхний слой с транзисторами, первый, второй, третий и четвертый слои металла.
Чип состоит из повторяющихся зон (типа сдвиговых регистров), и по таким картинкам было очень удобно его анализировать: сразу становилось ясно, что происходит на разных слоях. Я «отреверсил» самые «нафаршированные» участки с обилием логики, которые многократно повторялись. Но самым сложным оказалось отследить трассы, идущие по всему чипу, понять, какой внешний контакт к чему относится. С новогодних праздников до конца февраля, я, вооружившись новым прекрасным микроскопом, корпел над этой задачей – сидел на работе до десяти ночи, «реверсил», думал. И тут произошло новое чудо: товарищ смог организовать бесплатную фотосъемку чипа по слоям на электронном микроскопе в МИРЭА. «Фотосессия» крохи в 1 кв. см представляла собой 50 ГБ черно-белых фотографий.
Теперь все эти отдельные фотографии нужно было каким-то образом объединить в одну целую картинку. Чуть ли не в тот же день я написал на «питоне» программу, которая генерировала HTML-файл – при его открытии в браузере я получал требуемое. (Кстати, самая старая 10-я Opera справилась с этим лучше всего, рекомендую!) Затем на javascript написал еще одну программу, позволяющую сравнивать слои, плавно переходить между ними, выравнивать их, подбирать масштаб и т. д. Наконец, в моих руках были все инструменты для решения главных задач. Я отследил трассы, пронизывающие чип, и восстановил всю его структуру до последнего транзистора.
Еще одна фотография среза чипа, сделанная под рентгеном (в МИРЭА):
Рис. 7. Съемка под электронным микроскопом
Хорошо видны лунки, куда попадают сферы с ридами. Ниже располагаются три слоя металла, а еще ниже – слой с транзисторами.
Следующим этапом борьбы за светлое будущее стало создание под чип материнской платы. Спроектировал ее и отправил заказ на производство. А пока суд да дело использовал для работы с чипом плату «Марсоход-2» с FPGA. (FPGA – это, грубо говоря, массив из 10 000 универсальных логических элементов; программируя FPGA, мы можем получать любую логическую схему, легко обрабатывающую гигабитные потоки информации.) Прошивку для FPGA я написал сам, а кроме того, для динамического управления системой написал софт, который задает всю конфигурацию для FPGA. Потом вновь образовался полугодовой перерыв (ездил в командировку на Байкал, готовил в лаборатории установку, которую демонстрировали Путину). Но в конце концов звезды сошлись: у меня появилось время, приехали готовые платы – и я собрал свою систему.
Рис. 8. Создание «железа»
Подал все необходимые сигналы и – о, чудо! – увидел на осциллографе сигнал с чипа. (Осциллограф я купил когда-то за 6 000 рублей на eBay, еще 1 000 стоила прошивка к нему.) На картинке хорошо видны пятна – капельки какого-то реагента.
Рис. 9. Сигнал с чипа на осциллографе
Теперь мне нужно было придумать, как оцифровать эту картинку и передать ее на компьютер. Я собрал вот такую установку:
Рис.10. Схема прибора
Рис. 11. Готовая установка
Есть компьютер, который подает данные управления на плату с FPGA. Плата генерирует цифровые сигналы и отправляет их на чип. Сигнал с чипа идет на усилитель, далее – на АЦП на плате, оцифровывается и передается через COM-порт на компьютер. Вообще, пропускная способность COM-порта невелика: 15 килобит в секунду (т. к. в одном чипе находится от 1 млн до 10 млн «пикселей», а максимальная скорость передачи – 115200 бод). Тем не менее картинка на компьютер в итоге попадает.
Рис. 12. Обработанный сигнал на компьютере.
На фото выше видно, что, когда на использованный б/у-шный чип подается библиотека ДНК, чип заполняется неравномерно: по краям – в меньшей степени. Разные цвета обусловлены разным напряжением на pH-транзисторах. То есть мы можем ясно различить те лунки, куда попали сферы с ридами – впоследствии это поможет нам контролировать промывку чипа.
Соответственно, следующей задачей стала промывка чипа. Нужно было добиться, чтобы он стал, как новый. К счастью, у меня имелся совершенно новый чип в качестве референсного образца. На илл. А видно, что в активной области такой чип практически одного цвета (вертикальные повторяющиеся полосы – это просто шумы, наводки).
Рис. 13. Промывка чипа
На рис. 13 B неудачно промытый чип – он разноцветный. На рис.13 D – использованный, но хорошо промытый чип. Видно, что градиент по краям исчез. Тем не менее стоило бы еще доказать, что он действительно чистый и может использоваться повторно.
Поскольку библиотеки ДНК прикрепляются к танталовому покрытию чипа в кислой среде и открепляются – в щелочной (то есть при высоком pH), то чип промывается с помощью специальных полуавтоматических пипеток растворами с разными pH. На сегодняшний день мне удалось добиться практически полной очистки чипа.
У меня интересовались, почему, когда я полностью разобрался в структуре чипа, я не стал заказывать его изготовление, а предпочел по-прежнему искать и доставать б/у-шные, возиться с их промывкой и т. п. Да потому, что разработка микросхемы стоит огромных денег, миллионы долларов, и солидная часть этой суммы уходит на физическую отладку полученного продукта: подгонку, настройку всех параметров транзисторов и т. д. То есть просто скопировать логическую схему – недостаточно. Поэтому я беру условно бесплатную, уже готовую – спроектированную, изготовленную, отлаженную – микросхему и таким образом экономлю значительные средства, серьезно удешевляю проект.
Следующей моей задачей было собрать более продвинутый прибор, который позволял бы быстрее передавать информацию на компьютер и при этом не состоял бы из огромного количества отдельных плат.
Рис.14 Разработка следующей версии прибора
Я взял новую плату с FPGA – на том же кристалле здесь было 2 ARM-ядра с Linux, имелся Gigabit Ethernet и прочие «плюшки», но зато, в отличие от предыдущего варианта, не было АЦП. Позже спроектировал еще одну плату, с высокоскоростными АЦП и всеми другими необходимыми элементами. Запустил – все заработало.
Что осталось сделать для появления финального прибора? Всего три вещи.
Первое. Нужен гигабитный интернет, быстрая передача данных на компьютер. Это я реализовал буквально вчера.
Второе. Система подачи реагентов. Проектирование специального клапана уже в процессе.
Третье. Софт для обработки информации с чипа. С ПО пока есть вопросы, поэтому приглашаю к сотрудничеству программистов.
Финальный прибор стоит 10 млн рублей. Себестоимость секвенирования составляет несколько тысяч долларов. Чипы обходятся от 100 до 1000 долларов – в зависимости от количества «пикселей» в них. (К слову, восстановление чипов само по себе может стать неплохим заработком, особенно учитывая, что для промывки нужно сделать лишь пару кликов.) Реагенты тоже покупаются, но в перспективе будут создаваться и они.
В общем все это очень интересно, но главное – за этим будущее. Сегодня биотехнологии занимают в мировом научно-техническом прогрессе то же место, что компьютерные технологии в 80-х гг. прошлого века. При этом секвенирование – одно из ключевых направлений для современной биологии и медицины. Ну и, конечно, биотехнологии – это очень прибыльно.
В последнее время на рынке появился полупроводниковый секвенатор S5, и в ближайшее будущие я планирую переключиться на него.
Буду рад пообщаться со всеми, кто захочет тем или иным образом поучаствовать в развитии этого проекта!
Проект был бы не возможен, без теоретической подготовки Владимира Зубова. Выражаю ему свою благодарность.
Спасибо за внимание!
Сам себе экспериментатор
Как сделать биологическую лабораторию у себя дома
В нулевом приближении работа в биологической лаборатории похожа на приготовление еды. Только кастрюли, половники и ложки заменяются на пробирки с дозаторами, вместо продуктов нужно покупать химические реактивы и биологические препараты, а в конце результаты оцениваются не вкусовыми рецепторами, а на специальных приборах. В остальном все примерно так же. Хорошие инструкции, аккуратные руки, внимательность — и даже в домашних условиях вы сможете выделить ДНК, вырастить бактериальные культуры и отредактировать геном. N + 1 совместно с командой разработчиков «Авито» разобрался, как собрать простейшую биологическую лабораторию за пределами научного института или фармкомпании.
Инструменты и расходники: скрытые герои
Первое, с чем нужно определиться — это помещение. Вам понадобится 15-20 квадратных метров свободного пространства, 2-3 стола и компьютер для управления приборами и обработки полученных результатов. Также всячески рекомендуется, чтобы помещение было хорошо проветриваемым, имело окна, подключенный источник проточной воды и возможность установки вытяжки. Если с этими пунктами все получается, то можно двигаться дальше.
Почти в каждой научной статье есть раздел, в котором подробно описывается, какие приборы и методики использовали в своей работе ученые, но в этих текстах никто никогда не упоминает, например, о марках использованных нитриловых перчаток. Стеклянная посуда, халаты, микродозаторы — все это темная материя биологических исследований, исподволь влияющая на любые их результаты, и поэтому собирать нашу лабораторию мы начнем именно с этих мелочей.
Первое, что обязательно понадобится, — это халаты и одноразовые перчатки, которые не только защищают исследователя от опасных химических реагентов и патогенов, но и препятствуют загрязнению образцов вашими тканями. Также хорошо установить в домашнюю лабораторию ламинарный бокс, обеспечивающий условия для стерильной работы, и добавить к нему автоклав, ультрафиолетовую лампу и горелку, необходимые для обеззараживания инструментов и различных поверхностей.
Следующий обязательный пункт — это микродозаторы, с помощью которых можно с высокой точностью набирать фиксированные объемы жидкостей для приготовления растворов. Именно с них начинается путь многих молодых экспериментаторов, и иногда даже кажется, будто вся жизнь в лаборатории сводится к этим простым и почти медитативным действиям: насадил насадку на дозатор, набрал жидкость, вылил жидкость, снял насадку.
Другие мелкие расходники одной строкой: ступки и пестики для измельчения реактивов, штативы, разнообразные шпатели, скальпели, пинцеты и другие колюще-режущие инструменты, герметизирующая пленка парафильм (подкладку, на которую наклеен парафильм, тоже пускают в дело и традиционно используют для взвешивания). Полный список лабораторных мелочей может стремиться к бесконечности, и поэтому лучше всего раздобыть себе минимальный набор вроде оговоренного выше, чтобы, приступив к экспериментам, докупать недостающее оборудование в процессе работы.
Приборы: скелет лаборатории
Когда в 70-80-х годах прошлого века в лаборатории стали приходить антропологи, которые исследовали повседневную работу ученых, как до этого изучали туземные народы или маргинальные городские группы, то сперва они сильно удивлялись: никаких фонтанирующих открытий, озарений и Архимедов, выпрыгивающих из ванн, а вместо этого ежедневная рутина с постоянным повторением одних и тех же действий.
Во многом эти ощущения были верны. Так или иначе все научные эксперименты требуют систематичности и поэтому, наверное, около 90 процентов времени начинающего экспериментатора занимает ремесленная работа по обслуживанию научных приборов (с продвижением вверх в научной иерархии это соотношение неизбежно меняется).
Если пытаться как-то классифицировать наши покупки, то все приборы можно будет разбить на две большие группы. Одни из них помогают подготовить образцы для анализов, а другие — провести эти самые анализы.
Начнем с первой группы. Прежде всего нам понадобятся аналитические весы с точностью хотя бы на уровне миллиграммов (иначе будет очень сложно приготовить нужные объемы некоторых растворов). Кроме них в повседневной рутине наверняка пригодятся водный дистиллятор или тридистиллятор для очистки воды от солей и биологических примесей (правда, для точности первых экспериментов полностью хватит и обычных систем очистки питьевой воды), термостатирующий шкаф — инкубатор для выращивания культур, шейкер, холодильник с морозильной камерой, магнитная мешалка и центрифуга для разделения смесей (вместе с эппендорфами или другими пластиковыми емкостями). Все это устройства широкого научного профиля, необходимые не только в биологических, но и физических, химических, материаловедческих и прочих лабораториях.
Вторая группа, о которой говорилось выше, — это приборы для проведения различных анализов. Если бы инопланетяне попытались описать деятельность земных лабораторий с опорой на какие-нибудь численные метрики, то они наверняка назвали бы их фабриками по производству данных: таблиц, графиков, изображений и бесконечных массивов чисел. Поэтому приборы для проведения анализов — это ключевая часть лабораторий. Они позволяют проникнуть в природу процессов, происходящих за завесой рутины, и помогают представить результаты экспериментов остальному миру: коллегам, спонсорам, коммерческим партнерам и обычным людям.
Но достать эти научные приборы значительно сложней. Во-первых, они заметно дороже большинства перечисленных выше вещей (кроме, возможно, ПЦР-реактора и термошкафа), а во-вторых, в России их часто не продают физическим лицам. Поэтому стоит поискать возможность приобрести подержанные приборы (например, оптический микроскоп) или попытаться собрать их самостоятельно из более доступных комплектующих.
В интернете можно найти немало инструкций, как сделать своими руками самые разные приборы, например устройство для проведения гель-электрофореза, с помощью которого можно разделить ДНК или фрагменты ДНК по массам, что часто необходимо в генетических экспериментах. Некоторые умельцы рассказывают даже, как в домашних условиях смастерить секвенаторы — крайне дорогостоящие приборы, необходимые для определения последовательности ДНК.
Реактивы и препараты: ингредиенты рецептов
Еще ни слова не было сказано про реактивы и биологические препараты, с которых, естественно, начинаются все эксперименты. Этот разговор мы отложили не случайно. Если вы откроете сайт любой российской фирмы, торгующей этими «продуктами», то вас немедленно засосет водоворот бесконечных наименований, многие из которых сложно понять без фундаментального биологического образования: кислоты, соли, буферы, сахара, красители, питательные среды, ферменты, плазмиды и далее по списку.
Поэтому в выборе ингредиентов лучше всего отталкиваться от экспериментов, которые вы хотите провести, тем более что сейчас можно найти много подробных инструкций для таких экспериментов. В самых простых из них вроде выделения ДНК или выращивания бактериальных культур можно обойтись без дополнительных покупок.
Например, для выделения молекул ДНК может вполне подойдет свежая свиная печень: нужно отделить от нее маленький кусочек, нарезать его на мелкие фрагменты скальпелем и смешать в пробирке с раствором поваренной соли. После этого полученную смесь нужно процедить через фильтровальную бумагу в другую пробирку и добавить туда раствора додецилсульфата натрия. Это вещество разрушает клеточные мембраны и в результате молекулы ДНК будут постепенно выходить в свободной форме в раствор — останется только отделить от остального содержимого клетки. Для этого используют спирт изопропанол, предварительно охлажденный в холодильнике. Его осторожно добавляют в пробирку с разрушенными клетками, так чтобы изопропонал не смешивался с водой, и в результате на границе раздела воды и спирта начинает появляться мутноватый осадок, состоящий из молекул ДНК. Дальше останется только аккуратно извлечь его из пробирки, например, намотав на стеклянную палочку.
При этом специфические вещества в этом опыте можно заменить на более общедоступные: вместо додедцилсульфата использовать концентрированный раствор моющего вещества, а изопропанола — медицинский спирт. Но для более сложных экспериментов, например, создания генетически модифицированных бактерий, уже понадобятся разные специфические вещества, которые в России могут приобрести и физические лица.
Движение DIY-биологии еще очень молодо и пока не может соперничать с устоявшимися системами академической и индустриальной науки, но рано или поздно все может измениться. Во всяком случае, некоторые приборы, сделанные в гаражах, уже соперничают с индустриальными аналогами, да и наука, в конце концов, это не только история про достижения, но и про страстное желание просто что-то попробовать, поэкспериментировать. В том числе и дома, почему нет?
Только не забывайте: большие достижения будут случаться редко, а мелкие ошибки, наоборот, постоянно. Социолог и антрополог науки Бруно Латур даже называет лаборатории «технологическим аппаратом для обретения силы посредством умножения количества ошибок». Так что будьте готовы к неудачам и рутине, заведите лабораторный дневник — и вы обязательно приготовите что-то интересное.